pUC18T-mini-Tn7T-Zeo-gfpmut3 (Plasmid #65037)

pUC18T-mini-Tn7T-Zeo-gfpmut3 (Plasmid #65037)：

https://www.addgene.org/65037/

pUC18T-mini-Tn7T-Zeo-gfpmut3是Herbert Schweizer实验室构建的经典mini‑Tn7T单拷贝染色体整合自杀供体质粒，革兰氏阴性菌工具载体。

一. 核心元件：

1. 骨架pUC18T：pUC复制子（仅在大肠杆菌复制，在多数革兰氏阴性受体菌不能复制，自杀供体）；带oriT可接合转移；氨苄抗性 (AmpR) 用于供体大肠杆菌筛选。

2. mini‑Tn7T转座子：Tn7L+Tn7R 末端，依赖辅助质粒（如 pTNS2/pTNS3）提供TnsABCD转座酶，特异性插入细菌染色体glmS基因下游attTn7位点，单拷贝定点整合PMC。

3. 转座子内部：

- zeo：Zeocin 博来霉素抗性，受体菌整合后筛选标记；

- gfpmut3：高亮度突变型GFP，组成型表达（tac启动子驱动）；

- 转座子两侧有FRT 位点：可经Flp重组酶去除Zeocin抗性标记，实现无标记菌株。

二. 主要用途：

1. 革兰氏阴性菌稳定GFP荧光标记（最常用）。

将单拷贝gfpmut3整合到细菌基因组attTn7位点，获得稳定荧光菌株，不存在质粒丢失问题。

适用：铜绿假单胞菌、伯克氏菌、部分肠杆菌等带attTn7位点的革兰氏阴性菌。

2. 单拷贝报告基因系统构建。

可替换tac启动子，克隆待测启动子，构建启动子‑gfpmut3转录报告子，基因组单拷贝，避免多拷贝质粒带来的表达偏差，用于：

- 基因转录水平体内定量；

- 应激、药物、环境条件下启动子活性检测。

三. 实验操作要点：

1. 需要辅助质粒 (pTNS2/pTNS3)提供Tn7转座酶，二者共转入受体菌；

2. 受体菌用Zeocin筛选整合子；

3. 整合成功后供体质粒不能在受体复制，会丢失；

4. PCR 验证插入位点 attTn7(glmS下游)；

5. 供体大肠杆菌用氨苄筛选。

四. 与同系列载体对比：

- pUC18T‑mini‑Tn7T‑Gm‑gfpmut3：庆大霉素抗性；

- pUC18T‑mini‑Tn7T‑Tp‑gfpmut3：甲氧苄啶抗性；

- 本载体：Zeocin 抗性，适合菌株已有庆大 / 甲氧苄啶抗性背景的实验体系。

五. 局限：

1. 只用于有attTn7 位点 (glmS下游)的革兰氏阴性菌；

2. Tn7只能单拷贝插入；

3. gfpmut3由tac驱动，组成型强表达；如需诱导表达，需要更换启动子。

pUC18T-mini-Tn7T-Zeo-gfpmut3产品说明书.pdf

pUC18T-mini-Tn7T-Zeo-gfpmut3质粒序列.txt