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Super PCR Mycoplasma Test Kit 支原体 DNA 检测试剂盒可快速、稳定、高效的定性检测主细胞库、工作细胞库、病毒液以及细胞制品中是否有支原体污染，检测限为 5 Copys/Test。
预混引物根据 40 余种支原体设计，可准确检测各类支原体污染。本产品具有高广谱性、高灵敏度、高特异性、高保真度等优势，试剂盒组分简洁，操作步骤简单。
产品规格
名称 | AWR0273a 20T | AWR0273b 100T | AWR0273c 200T |
试剂A：Super PCR Mix① | 240 μL | 1.2 mL | 2.4 mL |
试剂B：MycoPOSI② | 20 μL | 100 μL | 200 μL |
试剂C：MycoNEGA③ | 20 μL | 100 μL | 200 μL |
试剂D：ddH2O | 0.5 mL | 1 mL | 2 mL |
试剂E：PRIF | 20 μL | 100 μL | 200 μL |
试剂F：PRIR | 20 μL | 100 μL | 200 μL |
① Super PCR Mix 已预混 DNA 聚合酶、dNTP、Buffer、Primer 等成分。
② MycoPOSI 为阳性参照 DNA 。为规避样品交叉污染，样品阳性条带大小为 350-550 bp，MycoPOSI 阳性条带大小为 700 bp。
③ MycoNEGA 为阴性参照。
保存条件
-20℃避光存储，干冰运输。
产品描述
支原体是已知最小的原核生物，约为0.1-0.3 μm ，其大小介于细菌和病毒之间，可透过常见过滤膜（0.22-0.45 μm )，且具有变形能力，因此常规的无菌过滤方法无法将其去除；由于其无细胞壁结构，常规抗生素对其生长无法起到抑制作用；支原体在生长过程中是依靠宿主提供营养，吸附在细胞表面，为细胞污染中最主要的污染物。支原体会影响宿主细胞的代谢，进而导致细胞生长缓慢、分化和衰老死亡等现象。
Super PCR Mycoplasma Test Kit根据支原体基因组中保守的 16SrDNA 和 23SrDNA 而设计，利用 PCR 技术直接扩增，兼具特异性和高灵敏性的特点，且本试剂盒检测范围广，可检测：(1) M . Hyorhinis ,(2) M . Fermentans ,(3) M . Arginini ,(4) M . hominis ,(5) M . orale ,(6) M . salivarium ,(7) M . pirum ,(8) Acholeplasma Laidlawii ,(9) M . agalactiae ,(10) M . bovis ,(11) M . buccale ,(12) M . arthritidis ,(13) M . pulmonis 等几乎所有常见的污染细胞的支原体（注： M ．为 Mycoplasma 的缩写）。以上 13 种支原体约占细胞支原体污染的 99％ 以上，绝大多数支原体污染集中于前 8 种。
质量控制
√ 通过细菌、真菌、支原体、内毒素检测。
√ 通过引物性能检测。
√ 通过渗透压、pH 检测。
√ 通过酶性能检测。
自备器材与试剂
PCR 仪、PCR 反应管、电泳仪、凝胶成像系统、高速离心机、琼脂糖胶、DNA Marker、Gel-Red 或其他核酸染料、超净工作台等。
样品预处理
1、 实验环境消除支原体；
2、 收取待检样品，于生物安全柜中小心吸取 1mL 细胞培养液，2000 rpm 离心 5 min；
3、 取900 μL 上清液至新 EP 管，沸水浴10 min。
4、 将煮沸过的检测样品 12000 rpm 离心 5-10 min ，取上清用于 PCR 检测。也可于 -20℃ 保存待检（为保证检测质量，建议即时检测，-20℃ 保存待检不超过 1-2 周）。
配制反应体系
1、 吸取 10 μL Super PCR Mix 至 0.2 mL PCR 管中，贴壁缓慢加入，防止产生气泡；
2、 吸取PRIF和PRIR各1 μL至 0.2 mL PCR 管中；
3、 继续吸取待检样品 3-5 μL 至 0.2 mL PCR 管中；
4、 用 ddH2O 将总体系补足至 20 μL。
建议检测体系如下表：
试剂 | 体积( μL) | 速算区 | 速算区 |
Super PCR Mix | 10 | ||
PRIF | 1 | ||
PRIR | 1 | ||
待检样品/MycoPOSI/MycoNEGA | 4④ | ||
ddH2O | 4 | ||
Total | 20 |
PCR反应条件：
96℃ | 96℃ | 55℃ | 72℃ | 72℃ | 4℃ |
3min | 15s | 15s | 25s | 5min | ∞ |
1 Cycle | 34 Cycles⑤ | 1 Cycle | 1 Cycle | ||
④ 为避免系统误差和检测准确度，模板样品添加量建议在 3-5 μL 之间，MycoPOSI/MycoNEGA 添加量 1 μL即可，用 ddH2O 补足至 20 μL总体系。
⑤ 34 Cycles 可常规检测支原体污染，若需检测低拷贝（5 拷贝）支原体污染，将循环数增加至 35-38 即可。
注：操作时产生的微量气溶胶可能造成样品间的相互污染，因此必须小心谨慎，避免剧烈操作，建议设置复孔。
PCR产物检测
1、 配制 1.5 % 琼脂糖凝胶（Gel-Red 或其他核酸染料染色）；
2、 取5 μL PCR 产物点样（无需再加溴酚蓝）；
3、 120V 电泳 15-20 min（可根据电泳仪情况适当调整参数）。
4、 用凝胶成像系统拍照留存，检查 MycoPOSI 和 MycoNEGA 泳道结果是否正常，判定对应样品是否有支原体污染。结果参照图：
产品性能
① 测试模板：MycoPOSI。
② 条带从左至右依次为109、108、107...101、5 Copys MycoPOSI 模板量。
③ PCR 反应体系与反应条件参考本说明书相关内容。
④ 本试剂盒可稳定检测各数量级支原体污染，最低可检测出 5 Copys 支原体污染/样品。
⑤ 琼脂糖凝胶：1.5%。
⑥ 电泳条件：120V，15 min。
⑦ 曝光条件：1500 ms。
性能对比
① 测试模板：细胞培养上清。
② 条带从左至右依次为 1-14 号上清样品。
③ 左图为本试剂盒测试结果，右图为S公司产品测试结果。
④ 图中对比可见，本试剂盒对样本检测灵敏度高，其中 2 号和 3 号样品 S 公司未检出；本试剂盒对样本检测特异性高，其中 6 号样品 S 公司检出非特异性杂带。
⑤ 琼脂糖凝胶：1.5%。
⑥ 电泳条件：120V，15 min。
⑦ 曝光条件：1500 ms。
注意事项
1、 使用本试剂盒前请仔细阅读本说明书全文。
2、 试剂盒中试剂使用前应在冰上融化并混匀，短暂离心。
3、 本产品的检测范围涵盖所有支原体种类。
4、 检测结果异常时，建议复检。
5、 检测结果为弱阳性时，建议使用支原体清除剂处理，培养 3-7 天后再复检。
6、为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。
7、 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
参考文件
《中国药典》2015版四部通则9201药品微生物检验替代方法验证指导原则
《中国药典》2015版3301支原体检查法
注意:
1.本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗。食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。
2.为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。
3.实验结果可由多种因素影响，相关处理只限于产品本身，不涉及其他赔偿。
